基因型

F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)pLysSCamR

簡要說明

OverExpress C43(DE3)、OverExpressC41(DE3)兩個(gè)菌株均起源于BL21(DE3)，其優(yōu)點(diǎn)是可以高效表達(dá)毒性蛋白或疏水性蛋白。OverExpress C41(DE3)跟BL21(DE3)的區(qū)別在于其基因組含有至少一個(gè)未知突變，這個(gè)未知突變使其獲得了高效表達(dá)毒性蛋白的能力，此突變位點(diǎn)參與大腸桿菌表達(dá)毒性蛋白時(shí)的細(xì)胞死亡途徑；OverExpress C43(DE3)來源于OverExpressC41(DE3)，是通過篩選OverExpress C41(DE3)對另一個(gè)不同毒性蛋白的抗性菌株獲得。C43(DE3)菌株具有比C41(DE3)更強(qiáng)的表達(dá)毒性蛋白和疏水性蛋白的能力。將具有l(wèi)u霉素抗性的pLysS質(zhì)粒導(dǎo)入C43(DE3)細(xì)胞中即是C43(DE3) pLysS，pLysS表達(dá)T7 yu菌酶，T7 yu菌酶可以與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)，非常適合毒性蛋白的原核表達(dá)。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。C43(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×108 cfu/μg DNA。

操作說明

1、C43(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，并用手撥EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。 

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的LB無菌培養(yǎng)液，37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。 

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 µg/mllu霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的LB培養(yǎng)基上。

 5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長，長時(shí)間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）。

4. 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。 

5. C43(DE3)pLysS 菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34 µg/ml lu霉素，以防質(zhì)粒丟失。