EHA101 Chemically Competent Cell  根癌(熱激)感受態(tài)細胞

基因型：

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR)Nopaline

簡要說明：

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——li福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA) 型Ti質粒含有篩選標簽：strep、kan，賦予EHA101菌株lian霉素抗性和ka那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作，經(jīng)pK7WGF2質粒檢測轉化效率可達104 cfu/μg DNA

操作說明：

1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2.每100μl感受態(tài)加1ug（體積不大于10ul）質粒DNA，用手bo打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當平板只含有50ug/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。

注意事項：

1.加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10 ；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。

2.混入質粒時應輕柔操作。

3.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

4.LI福平濃度不應高于25ug/ul，過高的LI福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5.培養(yǎng)基中加入LI福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入LIAN霉素或QING大霉素可防止Ti質粒丟失，但LIAN霉素不利于農(nóng)桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮LIAN霉素或QING大霉素，Ti質粒丟失的概率極低（可以忽略）。