EPI300 Electroporation-Competent Cell 克隆 (電擊) 感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

F – mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ?M15?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara,leu)7697 galU galK λ–rpsL nupG trfA dhfr.

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

EPI300電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。EPI300細(xì)胞含有一個(gè)突變的trfA基因，該基因表達(dá)出的蛋白產(chǎn)物可以促進(jìn)含有ori V復(fù)制子的質(zhì)粒的高拷貝擴(kuò)繁，誘導(dǎo)劑Ⅰ可以誘導(dǎo)trfA基因的表達(dá)。當(dāng)含有ori V復(fù)制子質(zhì)粒的EPI300細(xì)胞在LB/2YT或SOB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，trfA基因的表達(dá)被抑制，ori V復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)維持在很低的水平；當(dāng)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑Ⅰ，ori V復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)可維持在很高的水平，提高了質(zhì)粒產(chǎn)量。因此EPI300菌株可以降低ori V復(fù)制子質(zhì)粒的拷貝數(shù)，特別適合于各種不穩(wěn)定 DNA 或毒性基因的克隆。[mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI300菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（例如：哺乳動(dòng)物基因組DNA）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。lacZΔM15 標(biāo)記的存在使EPI300可用于藍(lán)白斑篩選，rpsL賦予其lian霉素抗性。此外，EPI300電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率ji高，特別適用于文庫(kù)構(gòu)建，EPI300電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>2×1010 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明：

一、0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5分鐘，待其瀝干水分，正置 5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置 5分鐘充分降溫。

二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；  B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，請(qǐng)用乙醇沉淀DNA 后加入適量 TE緩沖液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重懸，DNA 濃度不超過(guò)100ng/μl，體積不超過(guò) 5μl/50μl 感受態(tài)。

三、用200 μl槍頭將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

四、啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8kV(此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

五、2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 700 μl不含抗生素的無(wú)菌 S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至 5ml。37℃，225rpm 復(fù)蘇60 分鐘。

六、5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C 平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑 15cm培養(yǎng)皿2-5 個(gè)）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)13-17 小時(shí)。

注意事項(xiàng)：

（一）加入DNA 時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

（二）電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

（三）當(dāng)DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

（四）電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

（五）若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

（六）對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化， 最好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA 濃度不超過(guò) 100ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或過(guò)大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

（七）混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)不可用孔徑過(guò)小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應(yīng)剪去槍頭尖0.6cm)避免用力過(guò)猛，以免剪切力過(guò)大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

（八）電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。